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La mwcgMiniprep (o minipreparazione di DNA plasmidico) è una tecnica di laboratorio utilizzata in mwcwbiologia molecolare per l'estrazione, su piccola scala, di mwdaDNA mwdqplasmidico dai mwdgbatteri mwdwtrasformati che lo contengono. Le miniprep sono utilizzate durante i processi di mweaclonaggio per analizzare cloni batterici.

• Utilizzo

• Procedimento

• Crescita dei batteri

• Lisi

• Purificazione del DNA

• Note

L'uso di plasmidi permette di replicare il materiale genetico in batteri o per trasferire certi geni in altri organismi. La resa di plasmidi dipende da numerosi fattori: il ceppo batterico, il mwfaterreno di coltura utilizzato, il tipo di plasmide (i cosiddetti plasmidi ad alto numero di copie, mwfqhigh copy number o a basso numero di copie, mwfglow copy number) e le condizioni di coltura (agitazione, temperatura...). I batteri generalmente utilizzati per la replicazione di plasmidi esogeni sono della specie mwfwmwgaEscherichia coli.

Tale tecnica è utile allorquando si vogliano utilizzare dei mwggplasmidi come mwgwvettori di espressione o di mwhaclonaggio, per determinare, in genere dopo un passaggio di ligazione e di successiva trasformazione, quali cloni batterici contengano il plasmide di interesse.

Esistono diverse vie per ottenere una miniprep: il metodo classico utilizza tutta una serie di soluzioni o mwiabuffer che servono a compiere i diversi step dell'estrazione (dalla rottura delle cellule fino all'ottenimento del DNA plasmidico). Questa tecnica si basa sul processo di lisi alcalina, proposta da Birnboim e Doly nel 1979.cite-ref-doly-1-0[1]

Attualmente nei laboratori di ricerca vengono utilizzati dei kit forniti da diverse industrie del settore contenenti, già preparate, le soluzioni per l'estrazione del DNA; per ragioni commerciali, la composizione di ogni singola soluzione non è nota.

I plasmidi sono solitamente purificati a partire da colture liquide trasformate, seminate su terreno solido e isolate. I plasmidi ingegnerizzati sono solitamente dotati di uno o più geni in grado di conferire resistenza agli antibiotici (solitamente mwkqampicillina o mwkgkanamicina), che permette ai batteri che sono stati trasformati con successo di moltiplicarsi in un terreno di coltura selettivo. Nelle miniprep il volume di terreno liquido è di circa 1-5ml.

I batteri di ogni campione, dopo essere stati risospesi in un tampone isotonico, subiscono la lisi alcalina grazie all'aggiunta di un tampone contenente mwlqidrossido di sodio 0,2mwlgN e la successiva neutralizzazione con l'addizione di un tampone contenente mwlwsodio acetato. L'idrossido di sodio, oltre a rompere la parete batterica, mwmadenatura il DNA. La fase di neutralizzazione, riportando il mwmqpH ai valori fisiologici, permette la rinaturazione del DNA plasmidico superavvolto ma non di quello genomico, a causa delle grandi dimensioni di quest'ultimo.cite-ref-doly-1-1[1]

Dopo la centrifugazione dei campioni, che rimuove le membrane, le pareti cellulari e il DNA genomico, il DNA plasmidico in soluzione viene purificato tramite l'addizione di una soluzione mwoafenolo/mwoqcloroformio: le proteine vengono denaturate e solubilizzate nella fase organica inferiore mentre il DNA plasmidico si colloca nella fase acquosa superiore.

La fase acquosa viene prelevata e si procede con la mwowprecipitazione del DNA addizionando mwpaetanolo. Dopo la precipitazione si rimuove l'etanolo e il DNA precipitato può essere risospeso in acqua o in un altro opportuno tampone.

Un altro metodo di purificazione si ha con la separazione del DNA su gradiente di CsCl-EtBr.

cite-note-doly-11. ↑ mwrgJ. Doly, H.C. Birnboim, mwrwmwsaA rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA (mwsqmwsgPDF), in mwswNucleic Acids Res, vol.mwta 7, n.mwtq 6, 1979, pp.mwtg 1513-1523, mwtwPMIDmwua mwuq388356. mwugURL consultato il 1º maggio 2013.